简述微量层析柱的正确使用方法

　　第一步：选择与准备

　　根据目标分子的性质（大小、电荷、疏水性、特异性结合位点）选择合适的层析介质（如Ni-NTA用于His标签蛋白、DEAE用于阴离子交换）与柱型（预装柱或自装柱）。确认柱体积（如0.5mL、1mL）与样品量匹配，避免过载。检查柱体有无裂纹，出口是否通畅。

　　第二步：平衡

　　使用至少5-10倍柱体积（CV）的平衡缓冲液以恒定流速冲洗层析柱，使固定相充分溶胀并达到pH、离子强度的稳定状态。确保流出液的pH与电导率与平衡液一致，表明柱床已平衡。此步骤对分离分辨率至关重要。

　　第三步：上样

　　样品需预先离心或过滤（0.22μm），去除颗粒物，防止堵塞柱床。

　　样品体积通常不超过柱体积的1%-5%（体积比），浓度过高易导致拖尾。

　　用移液器沿柱壁缓慢加入样品，避免扰动柱床表面。

　　让样品进入柱床后，再加入少量平衡液冲洗进样环，确保样品全部加载。

　　第四步：洗涤

　　用3-5CV的洗涤缓冲液（通常与平衡液相同或略增盐浓度）洗去未结合的杂蛋白或非特异性吸附物。收集流出液，可通过SDS-PAGE或紫外吸收检测杂质去除效果。

　　第五步：洗脱

　　根据层析类型选择洗脱方式：

　　梯度洗脱：使用线性或阶梯式盐梯度（如NaCl0-1M）或咪唑梯度，逐步竞争性洗脱结合分子，分辨率高。

　　等度洗脱：用高浓度洗脱液一次性洗下目标分子，操作简单但可能共洗出杂质。

　　特异性洗脱：如用还原型谷胱甘肽洗脱GST标签蛋白。

　　以小体积（如0.5-1mL/管）分步收集洗脱液，及时进行检测（如Bradford法、A280测定）。

　　第六步：再生与保存

　　再生：洗脱后，用强洗脱液（如1MNaOH、6M胍盐）清洗柱子，去除残留蛋白，恢复结合能力。

　　保存：短期存于20%乙醇或平衡液中4℃；长期保存用含20%-50%乙醇的溶液，防止微生物滋生。

　　第七步：流速控制

　　使用恒流泵或重力滴加，保持流速稳定（如1mL/min）。过快降低分辨率，过慢延长实验时间。避免产生气泡。